作者：彩楓美國紅楓基地 發布時間：2012年8月2日
本文從加拿大紅楓愈傷組織的誘導開始，探討加拿大紅楓愈傷組織誘導的較適外植體以及較適增殖培養基，為較終建立加拿大紅楓組織培養快速繁殖體系奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 外植體來源
供給試驗的材料采自江西科技師范學院楓林校區花圃2009年引種栽培的生長狀況優良且無病蟲害的加拿大紅楓，分別取其葉片、葉柄、 帶莖頂芽和側芽為外植體。
1.1.2儀器與試劑
人工氣候培養箱；垂直流很凈工作臺；jj500型精密電子天平；電熱恒溫鼓風干燥箱；立式高壓蒸汽滅菌鍋；通風廚；Milli-Q很純水系統；實驗所用試劑均為分析純。
1.2 方法
1.2.1培養條件
經過初步試驗，選用1/2ms培養基作為基本培養基，添加0.7％瓊脂，３％蔗糖，并調節 ｐＨ 值至5.8-6.2，然后在121℃下高壓滅菌20min備用；同時植物生長激素（1mg/ml）也配好備用；整個培養過程在以下條件中進行：溫度（２５±２）℃，濕度65％，光照14ｈ/ｄ，對照組光照為24ｈ／ｄ，光照強度1500～2000ｌｘ。
1.2.2 外植體的無菌處理
將所取的外植體經初步處理后，在流水下沖洗40min后轉入很凈工作臺中，在紫外燈下滅菌30min，之后在很凈工作臺中進行無菌處理。無菌處理有葉、芽之分：葉片先經70％酒精處理10ｓ、12ｓ、15ｓ，然后用無菌水沖洗４～５次，接著用0.1％ HgC12處理3min、5min、7min，再用無菌水沖洗５～６次，較后用２％ NaClO浸泡處理20min后無菌水沖洗５～６次；葉柄、頂芽和側芽經70％酒精處理12ｓ、15ｓ、18ｓ，無菌水沖洗４～５次，接著用0.1％HgC12處理5min、7min、9min，用無菌水沖洗５～６次，較后用２％ NaClo浸泡處理25min，無菌水沖洗５～６次；處理過程中均需用鑷子攪動，以達到充分處理的目的。在無菌條件下，將無菌處理后的葉柄、帶莖頂芽和側芽切成約１～1.5cm的小段，葉片切成0.5～1cm2大小，其中直接接觸消毒液的切口部位必須切除，并保留芽部分或葉片含有經脈部分。將其接種于1/2MS培養基中，培養7d后按下列公式統計外植體的污染率：污染率＝（感菌瓶數＋燒死或褐化瓶數）／接種外植體的總瓶數×100％
1.2.3 植物生長調節劑對愈傷組織的誘導效應 以1/2MS培養基為基礎，挑選質地、大小及生長狀態相近的外植體接種于添加了不同濃度的６－芐基嘌呤、萘乙酸及赤霉素等植物生長調節劑的培養基上，每種培養基配方接種數為20瓶，每瓶一個外植體。觀察愈傷組織的誘導率，30d的出愈率：出愈率＝形成愈傷組織的外植體瓶數／接種外植體的總瓶數×100％愈傷組織以松脆狀、顏色鮮艷，生長旺盛為佳。
1.2.4 重復試驗
分別挑選加拿大紅楓健康枝條的葉片、葉柄、帶莖頂芽和側芽進行實驗，按照1.2.3方法培養，觀察出愈情況。
２ 結果與分析
２．１ 消毒處理方法
建立無菌培養系是木本植物培養的主要困難之一。外植體的選擇及處理是組織培養中一個非常重要的環節，外植體的生理年齡、發育階段和外植體取材的部位、健康狀態等都能夠直接導致外植體誘導愈 傷組織生理狀態的差異，從而影響組織培養的效果。外源菌與內源菌的同時存在以及滅菌的同時要保證外植體的生命力的要求給無菌處理加大難度。經過多次摸索比較，本實驗決定采用多種消毒液綜合使用的方法對外植體進行無菌處理。結果見表１。
| 外植體 | 編號 | 消毒處理酒精 | 接種瓶數 | 感菌瓶數 | 燒死或褐化瓶數 | 平均污染率 |
| 葉片 | 1 | 10s20min |
２０ |
１４ |
０ |
７０ |
|
2 |
10s→5min→20min |
２０ |
１１ |
０ |
５５ |
|
|
3 |
10s→7min→20min |
２０ |
８ |
０ |
４０
|
|
|
4 |
12s→3min→20min |
２０ |
７ |
０ |
３５ |
|
|
5 |
12s→5min→20min |
２０ |
４ |
1 |
25 |
|
|
6 |
12s→7min→20min |
20 |
0 |
9 |
45 |
|
|
7 |
15s→3min→20min |
20 |
0 |
11 |
55 |
|
|
8 |
15s→5min→20min |
20 |
0 |
15 |
75 |
|
|
9 |
15s→7min→20min |
20 |
0 |
20 |
100 |
|
|
葉 柄、 頂 芽、 側 芽
|
10 |
12s→5min→25min |
20 |
14 |
0 |
70 |
|
11 |
12s→7min→25min |
20 |
10 |
0 |
50 |
|
|
12 |
12s→9min→25min |
20 |
10 |
1 |
50 |
|
|
13 |
15s→5min→25min |
20 |
6 |
0 |
30 |
|
|
14 |
15s→7min→25min |
20 |
2 |
0 |
10 |
|
|
15 |
15s→9min→25min |
20 |
1 |
3 |
20 |
|
|
16 |
18S→5min→25min |
20 |
0 |
13 |
65 |
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17 |
18S→7min→25min |
20 |
0 |
16 |
80 |
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18 |
18S→9min→25min |
20 |
0 |
20 |
100 |
試驗結果表明：70％酒精、0.1％ HgCl2、２％ NaCLO的結合使用，比任何消毒液單獨或兩種結合使用的效果都好，且保持了外植體相對較強的生活力。由表１數據可以看出，不同的處理時間，外植體的污 染率也有所不同，隨著時間的增加污染率降低，且有葉芽之分。葉片以５號處理，而葉柄、頂芽和側芽則以１４號處理得到的污染率較低，分別為25％、10％。若消毒液處理時間再增加則開始出現褐化及燒死現象，不利于培養。
2.2 光照對愈傷組織誘導的影響
將加拿大紅楓葉片、葉柄、頂芽和側芽分別接種于12種不同植物生長調節劑配比的培養基中，進行14h/d及24h/d光照培養。觀察出愈時間和愈傷組織生長狀態。其結果見表２。
由表２可以分析出２種條件下誘導出的愈傷組織的生長速度及狀態的差異：24h/d光照培養的8d后有愈傷組織長出，其后生長的愈傷組織表面有一定的濕度，有光澤，質地疏松，顏色也較鮮艷；14h/d光照培養的11ｄ后開始有愈傷組織，其后生長的愈傷組織大部分都較干，致密而且顏色較深不鮮艷。30ｄ后統計出愈率以及對愈傷組織生長狀態的分析結果皆表明全光照培養更適合愈傷組織的誘導。
2.3溫度和濕度對愈傷組織誘導的影響
本實驗所采用的培養溫度為25℃，濕度為65％，有利于外植體愈傷組織的誘導。與艾麗皎等的研究報道相一致。
2.4植物生長調節劑配比對愈傷組織誘導的影響
以加拿大紅楓的葉片、葉柄、頂芽、側芽為材料，通過前實驗發現在不添加任何植物生長調節劑或單獨使用細胞分裂素（6-BA）、生長素（NAA）的培養基上誘導出愈傷組織需要很過25ｄ，而且愈傷組織生長很其緩慢，所以本實驗選擇加入一定濃度的植物生長調節劑以達到實驗目的，例如適量的加入赤霉素（GA3）有助于打破細胞休眠促進愈傷組織的生長。實驗通過將不同配比的細胞分裂素（6-BA）與生長素（NAA）添加于不同編號的1/2Ms培養基中，８ｄ后可誘導出愈傷組織，30d后計算出愈率，結果見表３。
注：植物生長調節劑濃度單位為ｍｇ／Ｌ。 植物生長調節劑及其濃度配比的確定是組織培養中一個非常重要的環節。通過將經無菌處理的外植體接種到培養基上培養，發現植物激素6-BA 和NAA濃度對外植體出愈率的影響有著顯著差異。由表３可以看出，隨著6-BA濃度的增加，出愈率出現先升后降的趨勢，在6-BA含量低的培養基上，愈傷組織產生的時間晚且速度慢；而在6-BA 含量相同的條件下，發現NAA含量低對愈傷組織的生長有促進的作用,如果含量過高卻只能起到抑制愈傷組織生長的作 用。本實驗綜合出愈時間、出愈率、愈傷組織生長狀態，得出：頂芽和側芽的相對較適培養基配方是４號；葉片的相對較適培養基配方是１號；葉柄的相對較適培養基配方是７號。
３ 小結與討論
適當的植物生長調節劑種類和濃度配比，不僅可以保證較高的出愈率，還可保證一定的出芽率及芽苗的生長質量。在初代培養中，既能產生愈傷組織，又有不定芽的分化，顯著縮短了的組培快繁周期，并且 可以有效地減少伴隨愈傷組織培養代數增加而產生變異的可能性，以保持組培品種的優良種性，這在組織培養中具有很為重要的意義。關于木本植物誘導愈傷組織的報道目前本就不多，而關于加拿大紅楓組織培養的報道資料就更加有限。所以，探索加拿大紅楓較適外植體和消毒方法來降低污染率、死亡率，以及尋求較佳的組培快繁技術途徑是非常值得研究的。試驗表明，加拿大紅楓不同外植體誘導的愈傷組 織長勢表現差異明顯，頂芽及側芽誘導出的愈傷組織長勢較好，顏色鮮艷且不會呈現干巴的狀態。在以1/2MS的培養基上，配合使用植物生長調節劑，均能誘導出愈傷組織，尤其是頂芽，在1/2MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA0.1ｍｇ/L＋GA30.1ｍｇ/L培養基中，接種８ｄ后就有愈傷組織產生，且出愈率高，愈傷組織狀態優良。葉片誘導出的愈傷組織，狀態相對來說有些不良，顏色為暗紅色，表面較干，而且葉片無菌處理難度較大；葉柄誘導愈傷組織能力較差，對植物生長調節劑的濃度變化敏感，不適宜被選作外植體。這為該屬植物的組織培養技術的建立提供了基礎實驗數據支持。然而，對于利用加拿大紅楓不同外植體誘導的愈傷組織進行再分化產生叢生芽，從而進行快速繁殖獲得新植株，以及建立加拿大紅楓組織培養快速繁殖的技術體系，還有待于進一步深入研究。